《细胞》子刊:准确预测 CAR- T 疗效,康奈尔大学刘东方教授课题组成功开发了新方法

2017 年,无疑是 CAR- T 大放异彩的一年,诺华的 Kymriah 和 Kite 的 Yescarta 凭借着良好的治疗效果,相继获批进入临床。

然而,作为一项新兴生物技术,CAR- T 也面临着许多问题。其中,非常关键的一个问题就是,如何预测一种 CAR- T 对于某个特定患者的疗效。毕竟,这些已经进入临床的 CAR- T 并不是百分之百有效;同时,未来随着许多不同类型的 CAR- T 相继进入临床,医生也很有必要为患者挑选一款最合适的产品。

近日,来自美国康奈尔大学医学院附属医院 Houston Methodist 研究中心微生物学与免疫学系的华人学者刘东方教授带领的研究团队,开发了一套全新的方案,通过量化免疫突触的质量,来预测 CAR- T 的疗效,并且证明了这一方案是准确可行的。这一发现发表在细胞子刊《分子治疗》杂志上 [1]。

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刘东方教授

为了更好的理解这一研究,我们需要简单了解一下目前常规的 CAR- T 检测项目以及 CAR- T 和免疫突触之间的关系。

目前,美国 FDA 发布的临床研究 CAR- T 比较常用的临床检测项目主要包括,CAR 转染阳性率以及 CAR 基因拷贝数,IFN-γ释放,CD4/CD8 的比例。这是在临床上进行 CAR-T 治疗前必须检测的项目。 然而,这些检测项目并不能对 CAR- T 的疗效进行预测。

而在临床前基础研究中,大多是通过分子生化等常规经典手段(如细胞因子释放测定,细胞毒性杀伤试验等),体外细胞模型以及体内动物模型检测对 CAR- T 疗效进行评估预测 [2]。这类方法不仅耗时耗力,而且重复性也很差,常常不同实验室会出现不一致的结果。

因此,在基础和临床科研中,我们迫切需要新的预测 CAR- T 疗效的策略与方法。

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为此,刘教授及其科研团队想到了免疫突触。

免疫突触 (Immunological Synapse, IS)是 T 细胞与靶细胞表面分子之间通过受体-配体相互作用得以紧密接触,形成了一个重要行使 T 细胞免疫学功能的精密结构。这一结构贯穿了整个 T 细胞的抗原识别,充分活化,以及下游激活事件 [3]。也就是说,免疫突触对免疫反应的形成至关重要。

同时,在前期研究中,刘教授证实,CAR- T 作为一类经过基因修饰赋予免疫细胞特异性抗原受体的 T 细胞群体,能够有效地与肿瘤抗原结合,并形成功能性免疫突触。同时,他还发现,不同的 CAR-T 细胞与其相关的肿瘤细胞形成的特异性免疫突触是不同的,它们的质量并不一样。[4,5]

因此, 刘教授推测,CAR- T 的免疫突触的质量或可作为一种手段来预测 CAR- T 的治疗效果。

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CAR 修饰的免疫细胞(蓝色)通过免疫突触与癌细胞接触(黄色)

为此,刘教授首先开发了两种互补的成像工具,一个是脂质双分子层(lipid bilayer)免疫荧光显微技术,另一个是垂直细胞配对系统(vertical cell pairing,VCP)。前者可以帮助人们观测到 CAR- T 细胞形成的免疫突触的完整结构,并对免疫突触的四个指标,F- 肌动蛋白在免疫突触的荧光强度,肿瘤抗原的聚集,T 细胞裂解颗粒(lytic granules, LGs)的极化以及重要下游信号分子的平均荧光强度进行量化。

而后者,可以清晰的观察到 CAR- T 细胞与靶细胞之间形成的免疫突触,同时,这一系统可以一次检测 3000 个免疫突触,显著提高了负载效率。

随后,刘教授便选择了人们常用的两种 CAR-T(CD19-CAR 和 kappa-CAR),以及针对这两种 CAR- T 分别设计的包含不同共刺激因子的 CAR-T(4-1BB-CAR T 和 CD28-CAR T)进行分析。结果发现,4-1BB-CAR T 形成的免疫突触无论是在 F - 肌动蛋白的荧光强度,肿瘤抗原的聚集程度还是肿瘤裂解颗粒的极化比例上,都要优于 CD28-CAR T。也就是说,4-1BB-CAR T 的免疫突触质量优于 CD28-CAR T。

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而此前的研究表明,T 细胞的免疫功能依赖于免疫突触的质量 [6]。因此,刘教授认为,4-1BB-CAR T 对肿瘤细胞的杀伤力优于 CD28-CAR T。

为此,刘教授首先采用了临床上检测 CAR- T 疗效的黄金标准,4 小时铬 51 释放实验以及细胞因子分泌对两种不同类型的 CAR- T 进行分析。结果发现,无论是常规的 4 小时铬 51 释放实验还是细胞因子分泌方法,都显示这两种 CAR- T 的抗肿瘤活性没有显著性区别。也就是说,临床常规检测方法并不能准确预测 CAR- T 疗效。

然而,当刘教授通过长期杀伤实验来评估这两种 CAR- T 的有效性和持续性时却发现,对于同一种癌细胞来说,4-1BB-CAR T 对癌细胞的杀伤力更大,可以更迅速的消灭癌细胞。同时,通过长期杀伤性实验数据分析发现,4-1BB-CAR T 的增殖能力相比于 CD28 CAR- T 更强。也就是说,事实上,相比于 CD28 CAR-T,4-1BB-CAR T 的体外抗癌活性更强。

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4-1BB CAR- T 的杀伤性(左图)和增值能力(右图)明显优于 CD28 CAR-T

随后,刘教授还通过对其他不同类型的 CAR- T 的免疫突触质量和抗癌活性进行了相关性分析,进一步证明了,免疫突触的质量可以有效预测 CAR- T 的杀伤活性以及增殖能力。

最后,刘教授还分别在淋巴瘤和实体瘤小鼠模型中证明了,免疫突触质量与 CAR 修饰的免疫细胞对癌细胞的杀伤力成正相关。即免疫突触质量越高,对癌细胞的杀伤力也越强。显然,这也为癌症的精准医疗提供了一个有利的方法。

下一步,刘教授还将通过验证已上市或者已经正在进行临床试验的 CAR- T 类产品,进行免疫突触功能测定试验,推进临床试验。

参考资料:

1.Xiong W, Chen Y, Kang X, et al. Immunological Synapse Predicts Effectiveness of Chimeric Antigen Receptor Cells[J]. Molecular Therapy, 2018, 26(4).

2.Vera J F, Brenner M K, Dotti G. Immunotherapy of human cancers using gene modified T lymphocytes[J]. Current gene therapy, 2009, 9(5): 396-408.

3.Fooksman D R, Vardhana S, Vasiliver-Shamis G, et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation[J]. Annual review of immunology, 2009, 28: 79-105.

4.Zheng P, Bertolet G, Chen Y, et al. Super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer[J]. Journal of visualized experiments: JoVE, 2015 (96).

5.Bertolet G, Liu D. The planar lipid bilayer system serves as a reductionist approach for studying NK cell immunological synapses and their functions[J]. Natural Killer Cells: Methods and Protocols, 2016: 151-165.

6.Dustin M L, Chakraborty A K, Shaw A S. Understanding the structure and function of the immunological synapse[J]. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(10): a002311.

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